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                          2022ELISA實驗攻略大全

                        1. 發布日期:2022-09-13      瀏覽次數:87
                          • 為了幫助科研初學者快速上手,減少實驗摸索的苦惱,我們專門整理了這篇干貨,為大家詳細介紹ELISA實驗流程和一些注意事項,一起來看看吧!


                            一、ELISA操作前準備工作


                            試劑盒的選擇:ELISA操作前,應做好實驗的設計、選擇適合自己檢測范圍和靈敏度的試劑盒,如恒遠生物高敏ELISA,提前訂購和準備試劑及耗材、處理樣本等準備工作。


                            樣本處理:在收集標本前需有一個完整的計劃,需要清楚要檢測的成份是否足夠穩定。ELISA檢測提倡新鮮標本盡早檢測,對收集后當天就進行檢測的標本,及時儲存在4℃備用,如有特殊原因需要周期收集標本,請取材后,將標本及時分裝后放在-20℃或-70℃條件下保存。因冰室與室溫存在一定溫差,蛋白極易降解,直接影響實驗質量,所以避免反復凍融。


                            二、ELISA標準品溶解


                            標準品是試劑盒的檢測抗原的一個度量標尺,因此標準品的溶解、倍比稀釋和保存要特別注意以下細節:凍干標準品溶解按照說明書的要求,準確復溶。在冰上操作標準品為佳,靜止5-10分鐘,輕輕搖勻后按照一次量分裝,在-20度或-70度保存。標準品嚴禁反復凍融。標準品的倍比稀釋應事先做好準備,如離心管的準備和編號以及稀釋液的準備;稀釋時,應充分混勻;采用進口或者硅化的EP管,減少蛋白吸附。在實驗孔內進行倍比稀釋時,注意操作規范,槍頭勿刮劃預包被的孔底。


                            三、ELISA操作中的洗滌


                            洗滌是ELISA實驗中是最多次數的操作,也是非常重要的步驟。不嚴格的洗滌容易出現洗不干凈或交叉污染現象,實驗重復效果差的現象。不管用多道加樣器、洗瓶、吸管,還是洗板機,嚴格按照說明書操作不要減少步驟洗滌的洗滌體積、洗滌時間和洗滌次數。注意標準化操作將減少實驗誤差和不同實驗之間的誤差。


                            a)洗液不要溢出孔外,以免污染相鄰的孔,特別是每次洗板的前兩遍,若高濃度的孔污染了低濃度的孔或空白孔,其造成的交叉污染的孔是洗不掉的,背景肯定會增高。


                            b)特別注意:設計實驗的時候要考慮實驗孔的位置,保證甩掉洗液時,空白孔、低濃度孔或陰性對照組在上面或一側或分開最好。同時注意甩掉洗液的動作翻轉(從正上方旋轉120-150度)要迅速、干脆。甩板不要手腕左右搖擺、旋轉來甩液體!甩出后以直線方式補2-3次甩出液體。


                            c)用干凈的濾紙,不要用衛生紙,因為細小粉塵或者碎屑容易吸附到孔底,導致洗板不干凈,結果偏高或偏低,重復孔的數值也會相差很大。


                            d)每次拍板不要重復在一個地方拍,特別是洗去酶的步驟;拍板不宜過輕,否則拍不干凈,拍板很用力不會對蛋白有什么影響。但注意不要太重,以至把板條給拍斷。每次洗板后輕叩幾下,最后一次一定要扣干凈。


                            e)不能減少洗液體積、洗板時間和次數。洗板時間太短,洗板效果不佳。延長洗板時間和增加洗板次數可以使背景更干凈。


                            四、ELISA的標準曲線如何擬合?

                            一般情況按照說明書推薦方法擬合標準曲線。標準曲線可以由酶標儀附帶軟件自動生成,也可手動制作。標準曲線呈“S"形曲線,兩端趨于水平,中間趨于線性,中間部分為較佳的檢測范圍。當標準品的量超過與包被抗體結合的量,此時標準品已飽和,再增加標準品的量,其OD值不再變化,故當標準品達到一定濃度后,曲線就趨于水平。一般給出的濃度范圍落在中間線性范圍,根據標準曲線,可以測出樣本的濃度。按照科學分析方法,如果存在“奇異點"或者“污點",直接采用線性分析不是很好,要對擬合標準曲線的幾個點進行取舍,同時也可改用雙對數直線擬合或者四因素曲線擬合。


                            今天的技術分享就到這里了,如果您有其他實驗問題可以關注“恒遠生物"微信公眾號或是聯系在線客服,為您提供專業的技術指導。


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